当格鲁（Steve Carell配音）带着三个小黄人重返昔日就读的反派学院时，整个地下犯罪世界都为之震动。这座名为“恶棍摇篮”的古老建筑里，正举行着年度反派颁奖礼。曾经的宿敌麦斯姆（Will Ferrell配音）站在聚光灯下，他不仅获得了最高荣誉，更向全场展示了自己通过蟑螂基因强化的恐怖身躯——直到格鲁带着反恶人联盟特工从天而降，将这场庆典变成了一场滑稽的追捕行动。
在麦斯姆的怒吼声中，一个尘封多年的童年恩怨被重新揭开。“三十年前那场才艺表演，你偷走了本该属于我的《变色龙》！”被押送的麦斯姆挣脱镣铐，他的昆虫复眼在黑暗中闪烁着仇恨的光芒。而此刻的格鲁正面临更棘手的难题：襁褓中的格鲁二世始终拒绝喊他爸爸，反恶人联盟主管塞拉斯（Steve Coogan配音）又带来麦斯姆越狱的噩耗。全家人被迫隐姓埋名搬进高档社区，连小女儿艾格尼丝最心爱的宠物山羊都不得不遗弃。
新环境里处处是令人啼笑皆非的危机。露西（Kristen Wiig配音）在美容院引发的化学爆炸让贵妇顶着冒烟的秃头狂奔，艾迪丝（Dana Gaier配音）在空手道课上一脚踢断了教练的趾骨，而格鲁则被邻居家酷爱犯罪的叛逆少女波比（Joey King配音）逮个正着。“帮我偷走恶棍学院的吉祥物，否则我就向全城公布你的真实身份”——这场荒唐的盗窃行动中，婴儿格鲁二世意外展现出驯服蜜獾的天赋，却不知吉祥物项圈里的追踪器正引着麦斯姆的昆虫大军逼近。
与此同时，五个接受超能力改造的小黄人正在城市上空制造灾难。他们有的双眼发射激光烧毁警车，有的变成巨石碾过中央公园，最离谱的那个把自由女神像像橡皮糖般拉长。反恶人联盟的“超级小黄人计划”彻底沦为笑柄，而真正的威胁已降临到格鲁家门口——坐着火箭轮椅的校长夫人（Chris Renaud配音）撞破墙壁，麦斯姆的蟑螂飞船正盘旋在屋顶。
高潮对决在摩天楼群间展开。被改造成蟑螂人的格鲁二世在亲情召唤下挣脱控制，父子联手将麦斯姆轰进垃圾处理厂。当所有经典反派在监狱监视器里看到格鲁与宿敌合唱《人人都想统治世界》时，这场横跨三十年的恩怨终于以最荒诞的方式落幕。片尾彩蛋中，恢复正常的格鲁二世奶声奶气喊出“爸爸”的瞬间，连最凶恶的罪犯们都忍不住跟着小黄人一起抹眼泪。