影片开场，山姆·威尔逊（安东尼·麦凯 饰）正在华盛顿特区慢跑。史蒂夫·罗杰斯（克里斯·埃文斯 饰）很快就追上了他。史蒂夫比山姆多跑了好几圈，直到后者累了坐下来休息。两人正式互相介绍。山姆是一名退伍军人，他知道史蒂夫一直在适应21世纪的生活，并且有很多东西需要补习。他推荐了马文·盖伊的《麻烦人》原声带来帮助他跟上过去几十年的节奏。史蒂夫将它加入了他的清单，清单上还有像《星球大战/星际迷航》和《洛奇》这样的东西。然后史蒂夫收到一条短信，让他到路边待命。一辆车停了下来，由娜塔莎·罗曼诺夫，也就是黑寡妇（斯嘉丽·约翰逊 饰）驾驶。她向两人打招呼，并让史蒂夫上车。
两人加入了由布洛克·朗姆洛（弗兰克·格里罗 饰）带领的其他神盾局特工，飞越印度洋。一艘名为“利莫里亚之星”的神盾局船只被以乔治·巴曹克（乔治·圣皮埃尔 饰）为首的海盗占领。他们扣押了人质，包括贾斯帕·西特维尔特工（马克西米利亚诺·赫尔南德斯 饰）。史蒂夫穿着他的美国队长制服，仅带着盾牌，没有降落伞就跳出了飞机。他落入水中，爬上船，击倒了所有挡路的暴徒。娜塔莎和其他特工跳下来协助队长。特工们击败了海盗，解救了人质，而巴曹克试图逃跑时被队长抓住。他们在船的甲板上搏斗，即使队长设法将他击倒，巴曹克也能迅速站起来。“我以为你不仅仅是个面具，”他得意地说。史蒂夫摘下他的面具回答说，“我们来看看。”他继续战斗，并用盾牌将巴曹克彻底击倒。
史蒂夫发现娜塔莎正在使用一个神盾局的闪存盘从船的电脑中提取文件。他为此质问她，因为他们的任务应该是帮助朗姆洛救出人质。她拔出闪存盘，就在这时一个海盗跑过，向两人扔了一枚手榴弹。史蒂夫抓住娜塔莎，在手榴弹爆炸前跳窗而出。
我们来到三曲翼大楼，神盾局总部。史蒂夫就娜塔莎任务背后的动机质问尼克·弗瑞（塞缪尔·杰克逊 饰）。弗瑞知道史蒂夫不会对此感到舒服，所以他找了娜塔莎。弗瑞提醒史蒂夫，他不能相信任何人，即使是与他紧密合作的人。他带史蒂夫乘电梯下到地下层，那里有三艘正在建造中的空天母舰，这是“洞察计划”的一部分，该行动将空天母舰与间谍卫星连接，用于预防任何可能的恐怖袭击。这部分是由于在纽约发生的事件，但史蒂夫认为这更像是一种侵略性的保护形式。弗瑞坚持让他接受这个计划。
史蒂夫参观了史密森尼博物馆，看一个专门为美国队长设立的展览。一个孩子认出了伪装的他，但他知道要保密。展品中有史蒂夫旧时突击队服装的人体模型，还有一个是他老朋友巴基·巴恩斯（塞巴斯蒂安·斯坦 饰）的模型，史蒂夫曾亲眼看到他坠亡。史蒂夫观看了一段他旧爱佩吉·卡特（海莉·阿特维尔 饰）的视频，视频中她纪念了史蒂夫作为队长的行动。他后来去探望了年迈的佩吉，她已经结婚并有了孩子。她病得很重，虽然她最初似乎认出了史蒂夫，但她又回到了以为是自他失踪后第一次见到他的状态，震惊地看到他还活着。他只是说，“我不能离开我最好的女孩。尤其是在她还欠我一支舞的时候。”
弗瑞试图访问娜塔莎在闪存盘上获取的文件，但他无法通过安全验证，这显然是他自己设置的。他去见亚历山大·皮尔斯部长（罗伯特·雷德福 饰），当时皮尔斯正就船只劫持事件与世界安全理事会开会。弗瑞告诉皮尔斯，他们需要推迟洞察计划。皮尔斯说可以，但他希望弗瑞能让钢铁侠去参加他侄女的生日派对。
史蒂夫找到山姆，当时他正在为其他患有创伤后应激障碍的退伍军人提供咨询。小组会议后，山姆向史蒂夫透露，他在战斗中失去了他的朋友莱利，莱利在空中被RPG击落。尽管如此，山姆仍然热爱飞行。他问史蒂夫什么能让他快乐。他不知道。
弗瑞开车时，联系了玛丽亚·希尔特工（寇碧·史莫德斯 饰）与他会合。一辆警车随后撞上了弗瑞的车。更多的车开了过来，还有一辆装满伪装雇佣兵的特警车。他们包围了弗瑞的车辆并开始射击。当他们用攻城槌来破门时，车辆的装甲开始变弱。弗瑞设法拿出了一挺迷你机枪，并向雇佣兵还击。他驾车逃离，两辆车紧追不舍，但他在一个十字路口甩掉了他们，那两辆车被一辆卡车撞毁。弗瑞命令车辆的电脑带他去一个安全的地方。在电脑找到地点之前，一个神秘人物出现并射出了一枚炸弹，附着在弗瑞的车上。炸弹爆炸，将车掀翻。刺客走向弗瑞，但他及时用激光武器烧出一个洞逃脱了。
史蒂夫回到他的公寓，发现他漂亮的女邻居（艾米丽·万凯普 饰）正要去洗衣服。他提出让她用他的洗衣机，但她说她刚在医院的传染病房待了很长时间，不想把病传染给史蒂夫。她告诉他，他把音响开着。史蒂夫听到音乐，小心翼翼地走进自己的屋子，拿起盾牌防身。他发现受伤的弗瑞坐在他的沙发上。弗瑞大声说他老婆把他赶了出来，但他通过手机上的文字告诉史蒂夫，可能有人在监听。还没等他说别的，弗瑞就被射了三枪。史蒂夫向窗外寻找枪手。弗瑞把闪存盘递给他，告诉他不要相信任何人。女邻居持枪进来。她是神盾局的13号特工，她照料着弗瑞。史蒂夫追赶那个刺客，就是街上的那个男人。史蒂夫撞穿墙壁，追上了外面的刺客。他向他扔出盾牌，但刺客一个迅捷的动作接住了它，然后又扔回给史蒂夫。他接住盾牌，抬头一看，却发现刺客已经消失了。娜塔莎在医院与史蒂夫会合，他们看着医生为弗瑞做手术。希尔特工也加入了他们。医生们试图抢救他，但弗瑞心跳停止了。他们宣布了他的死亡。之后，娜塔莎问史蒂夫为什么弗瑞会出现在他的公寓里。他声称不知道，就在这时朗姆洛告诉他他们需要他回神盾局。娜塔莎说史蒂夫是个糟糕的说谎者，然后他们分开了。我们看到史蒂夫也把闪存盘藏在了自动售货机的一包口香糖后面。史蒂夫被带去与皮尔斯谈话。他也问史蒂夫为什么弗瑞在他的公寓里，希望能找到凶手的线索。他们怀疑是巴曹克，因为前一晚他在一个安全屋被发现。皮尔斯暗示弗瑞雇佣海盗渗透船只，以便获取机密信息，然后在交易出错后被杀。史蒂夫否认了这一说法。皮尔斯再次问他弗瑞为什么在那里。史蒂夫只说弗瑞告诉他不要相信任何人。
史蒂夫跳上电梯，电梯里挤满了更多的神盾局特工，包括朗姆洛。史蒂夫注意到一个特工满头大汗，其他人的样子也很可疑。他问是否有人想出去，这促使他们所有人向他发起攻击。他们用磁力手铐铐住他的手腕，并用电棍电他，但史蒂夫制服了他们，将所有人打昏。西特韦尔通过监视器看到这一切，并命令STRIKE小队赶到电梯。史蒂夫用盾牌挣脱了手铐，看到STRIKE小队正向他走来。他弄断电梯的钢缆让电梯下坠。小队仍然在靠近，所以史蒂夫打破电梯的玻璃，跳到楼下。他跑到车库，骑上他的摩托车离开，躲避了神盾局设置的障碍。一架昆式战机出现并向史蒂夫射击。他将盾牌扔进螺旋桨，卡住了它，这给了他一个跳过飞机逃跑的机会。
西特韦尔命令神盾局特工留意史蒂夫。13号特工要求知道他们为什么要对美国队长下达搜捕令。皮尔斯走进房间，因他隐瞒弗瑞死亡的信息而将他标记为逃犯。史蒂夫回到医院，从自动售货机取回闪存盘，但它不见了。娜塔莎出现，嚼着口香糖。史蒂夫把她推进一个房间，要求知道她对那个神秘刺客了解多少。她知道那个刺客是冬日战士。他在伊朗的一次任务中差点杀了她，并且据报道在过去50年里，他已经对超过200起暗杀事件负责。他们决定利用闪存盘找出冬日战士的下落。皮尔斯再次与世界安全理事会成员会面，将弗瑞辩护为烈士，尽管他们认为他是因为试图掩盖自己的非法交易而被杀。他们都选择重新启动洞察计划。
史蒂夫和娜塔莎伪装成一对平民情侣去了商场。他们把闪存盘带到一家电脑店，插进一台MacBook Pro，发现信号来自新泽西州的惠顿。两人发现朗姆洛和其他神盾局特工从各个角落出现。娜塔莎拉着史蒂夫亲吻，以转移他们的注意力，因为公开秀恩爱会让人不舒服。这确实让朗姆洛感到了不适。两人开车前往信号引导他们去的一个废弃军事基地。史蒂夫认出那是他以前的训练基地，他短暂地幻想着以前瘦小的自己从身边跑过。他和娜塔莎进入了设施，那里被发现是神盾局的原始办公室。他们发现了霍华德·斯塔克和佩吉以及切斯特·菲利普斯上校的相框。史蒂夫在一个书架后面发现了一个装满电脑的房间。房间里唯一的现代科技是一个可以插入闪存盘的小接口。娜塔莎把它插进去并激活了一台电脑。一个德国声音开始说话并分析他们两人。这个声音属于阿尼姆·佐拉（托比·琼斯 饰），红骷髅的前同伙。在他的身体因病衰竭后，他将自己的意识转移到了一台电脑里。佐拉告诉两人，他和红骷髅的组织九头蛇是基于人类不可信赖其自身自由的信念而成立的，战后，神盾局招募了他和其他九头蛇特工，他们在那里密谋对抗他们的新雇主。他透露，他们直接策划了针对总统等人的行动，并造成了导致霍华德和玛丽亚·斯塔克死亡的车祸。佐拉补充说，一枚导弹正在不到30秒内飞向他们的位置。史蒂夫和娜塔莎在导弹击中时跳进一个洞里，摧毁了电脑。在建筑崩塌时，史蒂夫保护了自己和娜塔莎。朗姆洛和他的手下搜查了这个地方，以确保没有幸存者。
在他家中，皮尔斯向他的管家雷娜塔（布兰卡·卡蒂克 饰）告别，就在这时冬日战士出现在他的厨房里。他一言不发。皮尔斯开始和他说话，这时雷娜塔回来取她的手机。皮尔斯随后开枪杀死了她，因为她已经看到了他和冬日战士在交谈。
史蒂夫和娜塔莎藏在山姆的家里，知道他们绝对可以信任他。娜塔莎对她与九头蛇特工的牵连表示悔恨。山姆同意帮助他们两人，并动用了一个名为“猎鹰”的军事项目。回到华盛顿，西特韦尔在与斯特恩参议员（盖瑞·山德林 饰；重演他在《钢铁侠2》中的角色）会面后离开。在他们分手前，斯特恩凑过来对西特韦尔低语道，“九头蛇万岁”。山姆打电话给西特韦尔，命令他走到一辆车旁与他和他的朋友们会面。英雄们强迫西特韦尔上到一栋高楼的屋顶。史蒂夫把西特韦尔悬在边缘，威胁要扔下他。西特韦尔知道这不是史蒂夫的风格。史蒂夫同意了……让娜塔莎把西特韦尔踢下了屋顶。片刻之后，山姆穿着带有翅膀的猎鹰喷气背包套装，抓着西特韦尔飞上了屋顶。现在吓坏了的叛徒坦白说，佐拉创建了一个算法，可以根据任何个人事实或数据在全球范围内定位特定的人。他提到了托尼·斯塔克、布鲁斯·班纳和斯蒂芬·斯特兰奇（暗示未来的《奇异博士》电影）。目标是根据他们过去的行为来挑选的。这让西特韦尔意识到皮尔斯很可能会杀了他。
在返回三曲翼大楼的途中，冬日战士跳上英雄们的车，将西特韦尔从窗户拉出去，扔到了一辆卡车的路径上。刺客与其他九头蛇特工一起攻击这辆车。史蒂夫拉着娜塔莎和山姆出来，用车门在街上滑行。他们击退了反派，冬日战士追赶娜塔莎，而九头蛇特工则与史蒂夫和山姆战斗。冬日战士以为他找到了藏在车后的娜塔莎，并向她发射了一枚炸弹，但这其实是一个手机上播放的录音。当他真的找到娜塔莎时，他向她开枪。史蒂夫跳出来与冬日战士搏斗。这个刺客和史蒂夫一样快，甚至更强。史蒂夫设法摘下了他的面具，并最终得知了刺客的身份——巴基·巴恩斯。史蒂夫凝视着这个曾经是他的朋友的男人，无法相信他还活着并试图杀死他。“巴基？”，他问道。“巴基到底是谁？”，冬日战士回答。九头蛇特工随后将史蒂夫、山姆和娜塔莎拘留。
英雄们被一辆囚车带走。山姆注意到娜塔莎的肩膀在流血，告诉警卫她需要帮助。一名警卫拿出一根电棍，制服了另一名警卫。原来第一名警卫是伪装的希尔特工。她带英雄们去一个秘密设施为娜塔莎治疗，但首先她让他们看到了躺在床上的弗瑞，他还活着。他靠班纳开发的一种抗应激血清活了下来，这种血清最初是用来控制他的绿巨人问题的。当他和娜塔莎稍作休息后，他们与其他英雄们聚集在一起，讨论洞察计划将在几小时内启动，届时空天母舰将形成一个三角形，并锁定全球的目标。弗瑞拿出三块芯片，他们将用这些芯片来覆盖空天母舰的系统。他将指挥权交给史蒂夫下达命令。
在一家银行内，九头蛇特工们正在修复冬日战士在与史蒂夫战斗后受损的金属臂。他短暂地闪回了自己过去的生活，从他坠落的那一刻到他被佐拉和九头蛇特工找到。他的左臂被截肢，换上了金属臂。当他开始失控时，佐拉给他注射了镇静剂，后来又把他冰冻起来。皮尔斯进来，称赞冬日战士的工作，并要求他回来再做一次。冬日战士问起史蒂夫，声称认识他。皮尔斯命令特工们让他恢复到原来的杀戮心态。史蒂夫站在一座桥上，回忆着他和巴基共度的时光。一个闪回镜头显示，在史蒂夫母亲的葬礼后，巴基和史蒂夫在一起。巴基提出让史蒂夫住在他家，他只需要给他擦鞋就行了。山姆走过来，准备和史蒂夫并肩作战。史蒂夫让他穿上战衣，然后去美国队长展览馆拿回他的旧制服。保安（斯坦·李 饰）看到这一幕，评论说他要被解雇了。世界安全理事会成员在皮尔斯的引导下抵达三曲翼大楼。他给了他们电子别针，可以让他们进入大楼的任何地方。美国队长和猎鹰闯入总部。队长通过一个麦克风向所有扬声器广播。他告诉神盾局的特工们，皮尔斯是一个叛徒，他正在与九头蛇特工合作，他们必须阻止洞察计划的发生。朗姆洛和他的手下闯入控制室。他强迫一名特工释放空天母舰，但13号特工介入了。她迫使朗姆洛放下枪。他照做了，然后拿起刀割伤了13号的手臂，导致神盾局和九头蛇特工之间发生了枪战。朗姆洛在枪林弹雨中，设法自己释放了空天母舰。
队长和猎鹰向空天母舰前进，九头蛇特工试图向他们射击。队长将第一块芯片放入一艘空天母舰，而猎鹰则四处飞翔，躲避射击。他设法让一枚瞄准他的热追踪导弹击中一艘空天母舰，为他打开一个入口，让他将第二块芯片放入其中。与此同时，希尔监视着他们的进展，同时击退试图杀死她的九头蛇特工。
皮尔斯试图说服世界安全理事会成员加入他们的项目，把它说成是一个制服全球潜在攻击的和平努力。他递给辛格理事（伯纳德·怀特 饰）一杯香槟，但辛格拒绝加入他并扔掉了杯子。皮尔斯拔出枪对准辛格，但霍利理事（珍妮·艾加特 饰）踢开了辛格，然后击倒了房间里的其他九头蛇暴徒，并夺走了枪。她脱下伪装，原来是娜塔莎。她的后援来了，弗瑞从一架直升机上走下来，令皮尔斯大吃一惊。知道皮尔斯可能更改了视网膜扫描，弗瑞摘下眼罩，露出他伤痕累累的死眼，与皮尔斯一起覆盖洞察计划，因为他们是唯一需要这样做的最高级别特工。皮尔斯随后启动了他给理事会成员的别针，导致它深深地灼烧他们的胸骨。他威胁要对娜塔莎也这样做，迫使她和他一起走出去。娜塔莎自己启动了它，烧伤了自己，但没有那么深。弗瑞随后向皮尔斯开了两枪，杀死了他。他最后的话是“九头蛇万岁。”